周小飞5岁开始习武，是王世泉、韩燕武两位先生的弟子，兼习八极拳、八卦掌等拳械，擅长的功夫有剑、枪、拳、敦煌、跆拳道、套招，是国家“武英级”运动员。担任过江苏武术队、中国解放军八一武术队队长。

2002年，首次出演电视剧《群英会》，在剧中饰演饰演女二号小梅，是一个哑巴，自此开始演艺事业。

2006年，领衔主演动作功夫剧《功夫小英雄》，在剧中饰演跆拳道教练、敦煌派传人秋菊。

2009年，参演的风情功夫舞台剧《什刹海》在北京举行了首场演出。

2010年，在皮尔瑞·雷金纳德·迪奥执导的奇幻兼冒险片《巫师镇》中饰演中国侠客。同年在成龙、贾登·史密斯主演的动作电影《功夫梦》中饰演蛇女。

2011年11月18日，出演的历史题材电影《杨门女将之军令如山》上映，在片中饰演杨家烧火丫鬟，佘太君义女杨排风。

2012年，参演王家卫执导，梁朝伟、章子怡主演的动作电影《一代宗师》，在片中饰演金楼三姐。

2014年，在海涛执导的古装悬疑系列电影《侠僧探案传奇》第五部《洛阳花会》中饰演凌燕。

2015年，在林峯、迪丽热巴领衔主演古装传奇剧《六扇门》，在剧中饰演武艺高超，但是对爱人盲目崇拜的单青。

2017年4月18日，主演的动作电影《这位壮士》举行“请留步”概念发布会。

武术出身的周小飞拥有者扎实的基本功和过硬的身手，在电影《杨门女将》中，按照陈勋奇导演的严格要求，完成全套动作，受伤的她为了不影响到整个剧组的拍摄进度，她就像运动员比赛那样去打封闭，还要坚持拍摄，其敬业态度获得了导演的认可。而且在电影中她功夫底子沉稳扎实，加上优秀的技能，表现出了人物硬朗的气质，极有女人的柔又有强硬的刚。